nature method综述 | 解析冷冻样品制备中的“隐形之手”

 

 

 

冷冻样品制备中的“隐形之手”

 

 

近年来随着电镜硬件、数据分析软件和计算方法的持续进步,利用冷冻电镜解析生物大分子结构的效率被显著提高。

在单颗粒三维重构的整个技术路线中,冷冻样品的制备是关键步骤。众多科学家对于其充满兴趣,目前已取得了相当大的进展。但仍然存在很多困难,主要表现为结果不可控、可重复性差、没有通用的工艺参数。全靠不断摸索和运气来筛出可用的冷冻样品,过程费时费力且没有确定性,如同受控于『隐形之手』

 

近日,荷兰CryoSol-world公司和马斯特里赫特大学联合发表综述文章“Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM[1],分析了冷冻样品制备方法的研究进展和制样过程(样品优化、载网的选择和处理、样品沉积和冷冻玻璃化)的原理,抓住样品制备中的『隐形之手』,讨论了多种优化方案的优势和挑战,为冷冻样品制备的改进提供了参考

图:冷冻样品制备的不同阶段

 
 
 

样品优化

 
 
 

优质的样品是一切的基础。

实验者需要探索诸多条件来得到优质的样品,从湿实验室开始,需要探索设计基因构建、分离纯化生物大分子、调整pH值、加入盐或其他试剂模拟分子的自然环境等。对于膜蛋白的纯化,常需要添加去污剂、amphipols、磷脂纳米盘(nanodiscs)或SMA(styrene–maleic acid copolymers)来模拟脂质双层来稳定疏水性结构域。这些添加剂中,amphipols具有比去污剂更高的亲和力,磷脂纳米盘和SMA与脂质双层更相似[2]。在样品沉积在载网之前,还可以尝试在样品中添加去污剂,起到隔绝气液界面的作用。对于某些蛋白,还可以尝试使用化学交联的方法来保持其结构的完整性。

 
 
 

载网的选择和处理

 
 
 

载网是直径为3毫米的圆形网格,至少由两部分组成:网状底座和支持膜。网状底座由金属制成,材质常为铜,金或镍,起到机械支撑、电子束传导和散热的作用[3]。支持膜是带有微米大小孔洞的穿孔薄膜,被放置在网状底座上。

在载网的选择方面,最常用的是带有碳膜的铜网;进阶的选择有带有金膜的金网,可以增加导电和散热,从而提高稳定性[4];此外,还有镍钛合金支持膜(ANTcryo)载网,它不仅可以增加导电和散热,提高颗粒进孔率,还因为它是非晶材料,可以适配电镜常规合轴校准。

对于支持膜和样品之间的热膨胀差异导致的电子束致漂移(beam induced motion),可以通过减小支持膜孔洞尺寸来降低其影响[5]

载网的结构和材料以及处理方法,对于样品颗粒进孔率有极大的影响。目前提高颗粒的进孔率的方法主要有两种策略。第一种策略是在载网上添加一个可以粘附颗粒的连续薄膜,例如碳或石墨烯(氧化物)制成的连续薄膜。此外,还有Ni-NTA薄膜、抗体结合薄膜等,具有特异性的颗粒结合力。这种方法的优势在于可以增加每个孔的粒子数,还可以通过吸附生物大分子来隔绝气液界面的影响。第二种策略是采用化学处理,防止颗粒粘在有孔支持膜上。例如,聚乙二醇化处理[6]。这种方法的优势在于不需要额外添加连续支持膜,可以避免在显微照片中产生额外的背景噪声。

 
 
 

样品沉积

 
 
 

          

表1介绍了不同的样品沉积方法,这些方法可以分为三类,分别是印迹法、液滴法和划线法。

『印迹法』

印迹法仍是目前转移样品最常用的方法,常见主流设备如Vitrobot,EMGP,CP3均采用此法。将3-5μl的液滴用移液枪转移到用镊子夹住的载网上,然后用滤纸吸走载网上的多余液体,从而留下薄薄的样品层。设备通过控制一些条件参数,例如温度、湿度、滤纸吸附的时间和力度等来追求期望的液层厚度。

此方法的缺点在于印迹过程通常会持续几秒钟,样品的蒸发以及气液界面的影响可能会破坏样品,而且此方法几乎不具有可重复性。优点在于印迹仪器价格较低,操作的灵活性较高,可以采用多次印迹的方法在载网上富集生物大分子颗粒[7]

『液滴法』

通过超声喷雾、气压喷雾、静电喷雾或喷墨的方法将样品喷射形成多个小水滴,沉积在载网上。为了使喷射的液滴在支持膜上扩散开,常需要配合纳米线载网一同使用,这限制了此类方法在其他形式载网上的应用,同时也极大的提高了控制液体厚度和制样可重复性的难度。

由于可以在载网投入冷冻剂的途中完成样品喷射,从而可以节省处理时间。这样的快速过程将减少生物大分子与气液界面的相互作用,在改善气液界面问题上具有一定的效果。此外,其捕捉生物大分子的构象变化过程方面也具有巨大的潜力到目前为止,最快的装置在沉积和玻璃化之间的时间间隔只有6毫秒[8]

『划线法』

“划线”法中,划线元件尖端蘸取样品液滴,与载网表面保持几十微米的距离,样品在两者之间形成一个液体桥梁,随着划线元件在载网上的移动留下薄薄的一层样品湿膜。样品层的厚度由引入载网的样品体积以及划线速度和距离控制的,轨迹的宽度与划线元件的直径有关。

划线法的优点在于操作灵活且控制精准,制样的可重复性高,可以在一个载网上沉积多个样品,可以通过调节蒸发和冷凝实现样品的稀释和浓缩。此外,划线技术使用的样品量少,可以大大减少样品纯化所需的时间。不过划线法也有弱点存在,它的样品沉积时间大约需要一到几秒钟。

目前有两种技术采用此原理沉积样品。

针式书写技术

针式书写笔浸入样品液体中,蘸取亚纳升液滴书写在载网表面,实现样品沉积。期间,载网保持在露点温度,可以最大限度地减少液体的蒸发和冷凝。

毛细管书写技术

在毛细管书写技术中,样品溶液被吸进毛细管,然后用温和的压力挤出,以划线运动方式将样品送到载网表面[9]

 
 
 

冷冻玻璃化

 
 
 

样品在载网上沉积后,样品必须玻璃化以保持其内部特征。快速冷却是产生玻璃态冰和防止冰晶形成的必要条件。

『投入式冷冻』是将载网直接投入冷冻剂中,广泛用于1μm或更薄的样品玻璃化。当载网插入冷冻剂时,载网的外边沿先与冷冻剂接触,再通过载网的热传导使样品玻璃化。

『喷射式冷冻』最初被设计用于组织固定和冷冻替代。此技术使用AutoGrid,在冷冻样品玻璃化模块中喷射两股冷冻剂至载网中心,对准沉积的样品进行冷冻。测量表明,喷射式冷冻比投入式冷冻能获得更高的冷却速率。

越来越多的科学家关注于冷冻制样技术的研究,冷冻电镜技术可应用的界限也在不断被打破。冷冻制样环节中的『隐形之手』,将被逐一解开并获得控制。可控可重复的标准化冷冻制样技术终将推动冷冻电镜迈入新的时代。

文章链接:https://www.nature.com/articles/s41592-021-01130-6

参考文献:

[1]WEISSENBERGER G, HENDERIKX R J M, PETERS P J. Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM [J]. Nat Methods, 2021, 18(5): 463-71.

[2]AUTZEN H E, JULIUS D, CHENG Y. Membrane mimetic systems in CryoEM: keeping membrane proteins in their native environment [J]. Current opinion in structural biology, 2019, 58(259-68.

[3]KARUPPASAMY M, KARIMI NEJADASL F, VULOVIC M, et al. Radiation damage in single-particle cryo-electron microscopy: effects of dose and dose rate [J]. J Synchrotron Radiat, 2011, 18(3): 398-412.

[4]RUSSO C J, PASSMORE L A. Ultrastable gold substrates: properties of a support for high-resolution electron cryomicroscopy of biological specimens [J]. Journal of structural biology, 2016, 193(1): 33-44.

[5]NAYDENOVA K, JIA P, RUSSO C J. Cryo-EM with sub-1 A specimen movement [J]. Science, 2020, 370(6513): 223-6.

[6]MEYERSON J R, RAO P, KUMAR J, et al. Self-assembled monolayers improve protein distribution on holey carbon cryo-EM supports [J]. Scientific reports, 2014, 4(7084.

[7]SNIJDER J, BORST A J, DOSEY A, et al. Vitrification after multiple rounds of sample application and blotting improves particle density on cryo-electron microscopy grids [J]. Journal of structural biology, 2017, 198(1): 38-42.

[8]KLEBL D P, GRAVETT M S, KONTZIAMPASIS D, et al. Need for speed: examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales [J]. Structure, 2020, 28(11): 1238-48. e4.

[9]ARNOLD S A, ALBIEZ S, BIERI A, et al. Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts [J]. Journal of structural biology, 2017, 197(3): 220-6.

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