nature method综述 | 解析冷冻样品制备中的“隐形之手”

近年来随着电镜硬件、数据分析软件和计算方法的持续进步，利用冷冻电镜解析生物大分子结构的效率被显著提高。

在单颗粒三维重构的整个技术路线中，冷冻样品的制备是关键步骤。众多科学家对于其充满兴趣，目前已取得了相当大的进展。但仍然存在很多困难，主要表现为结果不可控、可重复性差、没有通用的工艺参数。全靠不断摸索和运气来筛出可用的冷冻样品，过程费时费力且没有确定性，如同受控于『隐形之手』。

近日，荷兰CryoSol-world公司和马斯特里赫特大学联合发表综述文章“Understanding the invisible hands of sample preparation for cryo-EM”^[1]，分析了冷冻样品制备方法的研究进展和制样过程（样品优化、载网的选择和处理、样品沉积和冷冻玻璃化）的原理，抓住样品制备中的『隐形之手』，讨论了多种优化方案的优势和挑战，为冷冻样品制备的改进提供了参考。

优质的样品是一切的基础。

实验者需要探索诸多条件来得到优质的样品，从湿实验室开始，需要探索设计基因构建、分离纯化生物大分子、调整pH值、加入盐或其他试剂模拟分子的自然环境等。对于膜蛋白的纯化，常需要添加去污剂、amphipols、磷脂纳米盘（nanodiscs）或SMA（styrene–maleic acid copolymers）来模拟脂质双层来稳定疏水性结构域。这些添加剂中，amphipols具有比去污剂更高的亲和力，磷脂纳米盘和SMA与脂质双层更相似^[2]。在样品沉积在载网之前，还可以尝试在样品中添加去污剂，起到隔绝气液界面的作用。对于某些蛋白，还可以尝试使用化学交联的方法来保持其结构的完整性。

载网是直径为3毫米的圆形网格，至少由两部分组成：网状底座和支持膜。网状底座由金属制成，材质常为铜，金或镍，起到机械支撑、电子束传导和散热的作用^[3]。支持膜是带有微米大小孔洞的穿孔薄膜，被放置在网状底座上。

在载网的选择方面，最常用的是带有碳膜的铜网；进阶的选择有带有金膜的金网，可以增加导电和散热，从而提高稳定性^[4]；此外，还有镍钛合金支持膜（ANTcryo）载网，它不仅可以增加导电和散热，提高颗粒进孔率，还因为它是非晶材料，可以适配电镜常规合轴校准。

对于支持膜和样品之间的热膨胀差异导致的电子束致漂移（beam induced motion），可以通过减小支持膜孔洞尺寸来降低其影响^[5]。

载网的结构和材料以及处理方法，对于样品颗粒进孔率有极大的影响。目前提高颗粒的进孔率的方法主要有两种策略。第一种策略是在载网上添加一个可以粘附颗粒的连续薄膜，例如碳或石墨烯（氧化物）制成的连续薄膜。此外，还有Ni-NTA薄膜、抗体结合薄膜等，具有特异性的颗粒结合力。这种方法的优势在于可以增加每个孔的粒子数，还可以通过吸附生物大分子来隔绝气液界面的影响。第二种策略是采用化学处理，防止颗粒粘在有孔支持膜上。例如，聚乙二醇化处理^[6]。这种方法的优势在于不需要额外添加连续支持膜，可以避免在显微照片中产生额外的背景噪声。

『液滴法』

通过超声喷雾、气压喷雾、静电喷雾或喷墨的方法将样品喷射形成多个小水滴，沉积在载网上。为了使喷射的液滴在支持膜上扩散开，常需要配合纳米线载网一同使用，这限制了此类方法在其他形式载网上的应用，同时也极大的提高了控制液体厚度和制样可重复性的难度。

由于可以在载网投入冷冻剂的途中完成样品喷射，从而可以节省处理时间。这样的快速过程将减少生物大分子与气液界面的相互作用，在改善气液界面问题上具有一定的效果。此外，其在捕捉生物大分子的构象变化过程方面也具有巨大的潜力。到目前为止，最快的装置在沉积和玻璃化之间的时间间隔只有6毫秒^[8]。

『划线法』

“划线”法中，划线元件尖端蘸取样品液滴，与载网表面保持几十微米的距离，样品在两者之间形成一个液体桥梁，随着划线元件在载网上的移动留下薄薄的一层样品湿膜。样品层的厚度由引入载网的样品体积以及划线速度和距离控制的，轨迹的宽度与划线元件的直径有关。

划线法的优点在于操作灵活且控制精准，制样的可重复性高，可以在一个载网上沉积多个样品，可以通过调节蒸发和冷凝实现样品的稀释和浓缩。此外，划线技术使用的样品量少，可以大大减少样品纯化所需的时间。不过划线法也有弱点存在，它的样品沉积时间大约需要一到几秒钟。

目前有两种技术采用此原理沉积样品。

针式书写技术

针式书写笔浸入样品液体中，蘸取亚纳升液滴书写在载网表面，实现样品沉积。期间，载网保持在露点温度，可以最大限度地减少液体的蒸发和冷凝。

毛细管书写技术

在毛细管书写技术中，样品溶液被吸进毛细管，然后用温和的压力挤出，以划线运动方式将样品送到载网表面^[9]。

样品在载网上沉积后，样品必须玻璃化以保持其内部特征。快速冷却是产生玻璃态冰和防止冰晶形成的必要条件。

『投入式冷冻』是将载网直接投入冷冻剂中，广泛用于1μm或更薄的样品玻璃化。当载网插入冷冻剂时，载网的外边沿先与冷冻剂接触，再通过载网的热传导使样品玻璃化。

『喷射式冷冻』最初被设计用于组织固定和冷冻替代。此技术使用AutoGrid，在冷冻样品玻璃化模块中喷射两股冷冻剂至载网中心，对准沉积的样品进行冷冻。测量表明，喷射式冷冻比投入式冷冻能获得更高的冷却速率。

越来越多的科学家关注于冷冻制样技术的研究，冷冻电镜技术可应用的界限也在不断被打破。冷冻制样环节中的『隐形之手』，将被逐一解开并获得控制。可控可重复的标准化冷冻制样技术终将推动冷冻电镜迈入新的时代。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41592-021-01130-6