“眼见为实”看清生命的奥秘！

      俗话说“眼见为实”，为了探究生命的奥秘，解答生物运转的规律，科学家们不断的探索如何可以看清生命的本质。但实际上想要看清生物大分子解答其运转机理，并不是一件容易的事。

如果要观察生物大分子的真实“样貌”，样本中就必须含水，因为水是生物材料中最丰富的成分。但是常温电子显微镜内的高真空环境与含水样品在真空条件下的快速蒸发相矛盾，所以传统的电镜用尽办法将其排除在外，采取了很多脱水制样的方法，但是生物样品脱水后“样貌”会发生巨大变化。为了观察到生物大分子的真实“样貌”，有科学家提出发展冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy，cryo-EM）来化解此矛盾。

图1 Fernández-Morán1966年制作的液氦温度低温电镜[1]

     自20世纪50年代以来，Fernández-Morán一直为冷冻电子显微镜的发展而奋斗，并于1966年制作了第一台液氦温度的冷冻电子显微镜[1]。Robert Glaeser及其团队证明了透射电镜的辐照损伤可以在低温下被有效降低[2, 3]。1974年Taylor和Glaeser通过电子衍射证明了过氧化氢酶晶体的结构在含水冷冻样品中可以完好的保存[4]。1982年，Jacques Dubochet研究组实现了在液态乙烷中快速冷却水形成玻璃态的冰，并在液氮环境下进行电镜观察[5]。如图2所示，玻璃态的冰在衍射图中没有规则的衍射间距，表明其是非晶体。Dubochet的工作奠定了冷冻电镜制样和观察的基础。另一方面，在1975年到2008年间，Joachim Frank研究组提出并完善了电镜图像处理的单颗粒算法，将电镜获得的二维平面模糊图像进行分析和分类叠加处理，最终得到更高分辨率的三维立体图像[6, 7]。

图2 三种冰的电子显微照片和电子衍射图[5]

冷冻电镜的兴起和发展，使得冷冻的生物样品可以在电镜中成像，实现了“眼见为实”。然而，低信噪比、模糊的电镜图像导致冷冻电镜在很长时间内只能应用于直径比较大的样品，如病毒，而且通常分辨率较低。

随着电子显微镜硬件和计算机技术的发展，各种单颗粒结构解析算法不断涌现，使上述困难得到了有效的克服。2008年，周正洪研究组率先发表了高对称病毒颗粒近原子分辨率的结构[8]，开创了应用冷冻电镜单颗粒技术解析生物大分子近原子分辨率的先河。

图3 胞质多角体病病毒衣壳的结构[8]

2013年前后，直接电子探测器、图像漂移修正算法、基于概率统计分析的重构算法相继出现，极大的推动了冷冻电镜技术的进步。直接电子探测器（direct detection device，DDD）能够直接探测电子数量，从而显著的提高了信噪比[9]；同时，DDD具有高速连续拍摄能力支持多帧拍摄，后期通过图像漂移修正算法，可恢复高分辨细节[10]。2012年Sjors Scheres课题组发表了基于最大似然和贝叶斯算法的单颗粒重构程序RELION[11]。成像系统硬件和计算算法的共同进步，使得冷冻电镜能够解析的分辨率不断上升。

2013年，程亦凡研究组先是解析得到20S蛋白酶体近原子分辨率的三维结构[12]，紧接着又于同年12月与David Julies组联合发表了TRPVl蛋白3.4 Å的高分辨结构，并在此基础上搭建了原子模型[13]。这无异于开创了分辨率革命，冷冻电镜进入了新纪元[14]。目前已报道的利用单颗粒三维重构技术解析的生物大分子的最高分辨率为1.2 Å[15]，最小分子量约为40 kDa[16]。

      虽然冷冻电镜单颗粒三维重构技术已经获得了巨大的成功，但利用此技术解析生物大分子结构仍然很困难，其中的瓶颈主要集中在无法精准控制冷冻样品制备上。所以此技术的下一个突破口是样品制备方法上的革新，急需精准控制冷冻样品制备的全过程，从而获得可重复的实验结果，拓宽冷冻电镜单颗粒三维重构技术的应用范围。

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参考文献：

[1]   FERNÁNDEZ-MORÁN H. High-resolution electron microscopy with superconducting lenses at liquid helium temperatures [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1966, 56(3): 801.

[2]   GLAESER R M. Limitations to significant information in biological electron microscopy as a result of radiation damage [J]. J Ultrastruct Res, 1971, 36(3): 466-82.

[3]   GLAESER R M, HOBBS L W. Radiation damage in stained catalase at low temperature [J]. J Microsc-Oxford, 1975, 103(2): 209-14.

[4]   TAYLOR K A, GLAESER R M. Electron-Diffraction of Frozen, Hydrated Protein Crystals [J]. Science, 1974, 186(4168): 1036-7.

[5]   DUBOCHET J, LEPAULT J, FREEMAN R, et al. Electron-Microscopy of Frozen Water and Aqueous-Solutions [J]. J Microsc-Oxford, 1982, 128(Dec): 219-37.

[6]   SHAIKH T R, GAO H X, BAXTER W T, et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs [J]. Nat Protoc, 2008, 3(12): 1941-74.

[7]   FRANK J, SHIMKIN B, DOWSE H. Spider - a Modular Software System for Electron Image-Processing [J]. Ultramicroscopy, 1981, 6(4): 343-57.

[8]   YU X K, JIN L, ZHOU Z H. 3.88 angstrom structure of cytoplasmic polyhedrosis virus by cryo-electron microscopy [J]. Nature, 2008, 453(7193): 415-U73.

[9]   MILAZZO A C, MOLDOVAN G, LANMAN J, et al. Characterization of a direct detection device imaging camera for transmission electron microscopy [J]. Ultramicroscopy, 2010, 110(7): 744-7.

[10] SHIGEMATSU H, SIGWORTH F J. Noise models and cryo-EM drift correction with a direct-electron camera [J]. Ultramicroscopy, 2013, 131(61-9.

[11] SCHERES S H W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination [J]. Journal of structural biology, 2012, 180(3): 519-30.

[12] LI X M, MOONEY P, ZHENG S, et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM [J]. Nature Methods, 2013, 10(6): 584-+.

[13] LIAO M F, CAO E H, JULIUS D, et al. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy [J]. Nature, 2013, 504(7478): 107-+.

[14] KUHLBRANDT W. Biochemistry. The resolution revolution [J]. Science, 2014, 343(6178): 1443-4.

[15] NAKANE T, KOTECHA A, SENTE A, et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution [J]. bioRxiv, 2020, 2020.05.22.110189.

[16] FAN X, WANG J, ZHANG X, et al. Single particle cryo-EM reconstruction of 52 kDa streptavidin at 3.2 Angstrom resolution [J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1-11.