VitroJet ：新功能与案例研究
VitroJet：新功能与案例研究
在本文中，我们将展示VitroJet的最新发展。我们将阐述从VitroJet的原型到当前最先进版本的技术进步，包括集成亲水化处理、样品针式书写、光学冰厚度测量和喷射冷冻玻璃化的升级。最后，将展示一系列不同样品类型的案例应用与研究。
技术上的改进
兼容各种载网类型
增加制样温度选择
自动计算冰层厚度
内置等离子清洗
●采用不锈钢与玻璃材料搭建真空室与等离子源，以防止材料的溅射。
●调整Autogrid与等离子之间的距离以防止对载网的离子轰击。
●气瓶可以连接到系统，以进一步优化亲水化处理，并确立与不同载网类型的兼容性。
●可选择跳过等离子清洁的过程。
●可选择书写过程中的温度，有4°C与20°C可选择。可选择书写后是否进行冷冻。电动移液管引入样品5微升，可用作最多12次载网的针式书写。
●书写笔直径增加到150微米，且提供多种书写模式。增加了增强定位精度的马达。可使用打圈的书写方式获得最广直径800微米的涂抹区域，同时可保持恒定书写速度。
●新开发可容纳12支书写笔的笔筒，每进行一个周期，一支书写笔从笔筒抽出并送入气候腔室，结束书写后收回，因此可最多在12次书写后将笔筒拿下移动至清洗站进行集体清洗烘干，节省时间。
书写过程监控的改进
●进一步改进了摄像头，以获得具有增加分辨率帧率和视场的书写图像。
●采用单色摄像头增强画面对比度。通过液管摄像头可视化了书写笔吸取样品的过程。
●新增函数算法在摄像头的成像中测量出冰层厚度，误差20nm以下，并在10-40nm范围内达到10nm以下。
图1 书写监控位置及冰层厚度计算
●2升杜瓦瓶保存足够的液氮以便进行Autogrid的储存以及乙烷的液化。容量足以允许90分钟的冷冻储存时间，结束试验后，打开抽屉可获取装有样品的Grid Box。
亲水化处理
自动制备载网
减少样品用量
提高自动化程度
减少操作人员依赖
●将用户设置分到四个阶段，分别是：
① 选择温度与是否冷冻；
② 手动放入Autogrid并清洗笔筒；
③ 设置处理Autogrid书写环境与方式并进行加样；
图2 人工操作四步骤
●VitroJet兼容所有可以装配到Autogrid上的载网类型。
●取样仅需0.5微升，每一次书写仅需0.5纳升，所需样品量极少，且操作员可以选择在开始处理每个网格之前是否装载新样品。
案例研究
①膜蛋白
④脂质纳米粒子
②核小体
⑤烟草花叶病毒
③脂肪酸合酶
⑥巨型病毒
为了测试 VitroJet 在高通量设置中的适用性，作为测试案例，处理了一个分子量约为100 kDa，尺寸为10 nm 的膜蛋白。测试结果显示，针式书写区域冰厚度呈平滑梯度分布，筛选过程中观察到了随机的颗粒分布，制样重复性高。从两个载网收集的数据合并，产生具有广泛颗粒方向的2.7埃分辨率重构。VitroJet极大地简化了冷冻电镜载网的制备过程，制样质量非常高。
核小体在Vitrobot制样存在取向偏差问题，降低了结构测定的效率。在VitroJet上使用Quantifoil 200目载网进行制样，最佳效果是产生约10个可用的Square供数据收集，可进行3.0埃分辨率的重构。VitroJet明显改善了取向偏差问题。
酵母脂肪酸合酶(FAS)是一种分子量为2.6 MDa、直径为27 nm的酶。新鲜纯化的FAS在VitroJet上与UltrAuFoil载网上玻璃化，并使用能量滤波的K3相机对 完整书写区域进行了 200 kV Talos Arctica拍摄，生成了共计3696张显微图。从这些图像中，使用45979个颗粒进行了3.3埃的D3对称3D重建。密度图显示了具有足够分辨率进行原子模型构建的明显侧链特征。
图3 脂肪酸合酶三维重构及侧链细节
VitroJet配合连续2nm碳支撑膜的Quantifoil载网进行LNPs制样。30秒亲水化处理并以2-5 mm/s的速度进行书写可获取适合的可重复冰厚度。冷冻电镜成像展示了LNPs的大小分布，并揭示样品的形态，从而建立稳健的基于LNP的项目工作流程。
VitroJet配合Quantifoil载网进行制样，收集了103个Square的iDPC-STEM 显微图，收敛半角（CSA）为2.0mrad，从中选择13644个颗粒进行3维重构，分辨率5.4埃，这是在理论上最大的STEM分辨率。Jet玻璃化减少了非玻璃状冰区域，并改善了该数据收集的样品。
图4 烟草花叶病毒三维重构图
大型病毒颗粒的书写，对VitroJet原型而言是具有挑战性的。但随着书写笔头直径增加到150um，书写范围增大，这个障碍被扫清了。本研究使用的50nm蜱传性脑炎病毒，在每个hole中可检测到多达18个颗粒。而150nm壳直径和120nm尾部的噬菌体FJy-3，在32个hole中可检测到一个颗粒，可见对于巨型病毒的书写以及玻璃化，VitroJet也可有效地进行。
图5 VitroJet制样的工作范围内颗粒电镜图像
原文链接
https://journals.iucr.org/d/issues/2024/04/00/ih5005/index.html
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