冷冻样品制备操作流程

冷冻样品制备操作流程：Leica EM GP2 投入式冷冻仪

ANTcryo 技术文档 TN-001 · Rev. 1.1 · 2026-01-01

1. 仪器与耗材

• ANTcryo 载网（膜面为无反光的哑光面）ANTcryo
• 辉光放电／等离子清洗仪（如 Gatan Solarus、PELCO easiGlow、Quorum GloQube Plus、Harrick Plasma）
• Leica EM GP2 投入式冷冻仪
• 液氮（LN₂）；乙烷，或 63/37 乙烷/丙烷混合气
• 滤纸（预打孔 Whatman No. 1 或 541）
• Leica GP2 专用镊子；精细载网镊
• 载网存储盒；低温手套与防护面罩

2. 载网储存与取用

• 载网存放于原装网格盒中，置于避光、阴凉、低湿环境；为保证表面质量，建议在生产后 2 年内使用。ANTcryo
• 潮湿环境下，载网应密封保存在干燥容器内，使用前约 30 min 取出，平衡至室温。ANTcryo
• 使用前在光学显微镜下检查：只要支持膜无明显破损、孔型结构完整，即使载网曾被气流短暂吹飞，仍可正常使用。ANTcryo
• 特别说明：ANTcryo For Cell 系列载网（MS01/MS03）出厂时已完成亲水化处理，可直接使用；长期存放后，建议先做一次短时间等离子处理。ANTcryo

3. 辉光放电（亲水化）

辉光放电使支持膜表面转为亲水，这是获得均匀冰层、让颗粒留在孔内的前提。辉光放电处理后的载网应在 30 分钟内使用（亲水性随时间衰减）；部分流程建议在 15 min 内使用。[Wang & Zimanyi 2024；Leica App Note 2017]

3.1 推荐参数

将载网膜面朝上放置在辉光放电腔室内的载玻片（或载网架）上。

3.2 ANTcryo 专属说明

• 非晶镍钛合金耐辉光放电性能好，可按需增加时间与强度。作为参照，金膜载网常用的处理时间约为 120 s [Wang & Zimanyi 2024]。ANTcryo
• 新批次首次使用时，先试 2–3 张载网摸索最佳参数，再正式上样。ANTcryo
• 单颗粒分析（SPA）的常见做法（PELCO easiGlow）：空气辉光放电 20–30 mA，碳膜 20 s，金膜 120 s，超薄碳膜 5 s。[Wang & Zimanyi 2024]

4. Leica EM GP2 冷冻仪设置

冷冻仪的操作遵循已公开的 Leica EM GP2 标准操作程序。[Leica GP2 SOP，cryoemcenters.org；Leica EM GP2 应用手册「Plunge Freezing of Microtubules」]

4.1 环境腔室

4.2 每日首次使用前

• 在 blot 臂上装好新滤纸，于腔室内平衡 15–20 min 后再开始 blot。滤纸每 10 次 blot 或 20 min 更换一次，以先到者为准。[Leica GP2 SOP]
• 加湿器注入蒸馏水（约 60 ml）；冷冻腔加注液氮；待腔室降至约 −175 °C 以下，将乙烷冷凝至冷冻剂杯中。[Leica GP2 SOP]
• 在镊子上装载空白载网，调整 blot 的水平/垂直位置，然后跑一次空 blot 循环。

4.3 GP2 的 blot 参数（与 Vitrobot 的差异）

GP2 没有"blot force"调节旋钮，blot 由 blot 时间 + blot 位置控制（镊子与 blot 臂位置一次设定后固定，机内红外 blot 传感器会额外把滤纸朝液滴方向微调推进）。

• ANTcryo 载网起始值：blot 时间 2.5–4 s，传感器推进 +1.4 mm，从膜面一侧 blot。ANTcryo —— 由 Vitrobot 标准参数推演而来，非 GP2 单独发表的数值。
• ANTcryo 支持膜耐受 blot 的能力较好；在 Vitrobot 上我们的标准参数是 blot time 3 s、force 2、blot 1 次，可稳定获得薄而均匀的冰层（见第 6 节）。在 GP2 上建议从 2.5–4 s 起步，用两三张载网摸索冰层厚度。ANTcryo

5. 上样

• 每张载网使用 3–4 µL 样品（典型值）。GP2 的 blot 传感器按约 4 µL 设计；3 µL 亦可稳定使用。[VIB BECM GP2 SOP；Nat Commun 2025]
• 将液滴加在膜面一侧；移液器吸头不要触碰支持膜。
• 浓度起始值ANTcryo：
  • Apoferritin：1–1.5 mg/ml，作为标准参照（必要时筛选 2–3 个浓度）
  • 对于稀缺或难处理的样品（如膜蛋白）：镍钛表面的低吸附特性可让更多珍贵样品留在孔内；先小批量试制再放大。ANTcryo
• 可选：在湿度腔室中将液滴在载网上孵育 20–30 s 后再 blot（吸附/孵育有助于提高部分样品的颗粒密度）。[Nat Commun 2025；Leica App Note]

6. 预期冰层表现（ANTcryo）

• 镍钛膜表面平整、亲水性均一，有利于形成 20–80 nm 的均匀冰层，减少冰层厚薄梯度。ANTcryo
• 在我们的 Vitrobot 标准参数下（blot 3 s / force 2 / 1 次），获得约 20 nm 冰层的成功率明显高于常规碳膜。在 GP2 上预期有相近的参数窗口，请用最初几张载网验证。ANTcryo

7. 投入冷冻与转移

1. 将辉光放电后的载网装到 Leica GP2 镊子上（膜面朝向将要加样的一侧），把镊子卡入 plunge 杆。
2. 按 "LOAD SPECIMEN"，通过侧口加样。
3. 按 "BLOT"（若启用自动 plunge，blot 结束后会自动投入）；载网投入液态乙烷。
4. 投入后，在液氮浸没状态下将载网从乙烷杯转移至转移容器中载网盒的空槽内。
5. 载网盒存放于液氮中，直至筛选或数据采集。

8. 故障排查

9. 参考来源

本文档作为技术支持资料提供。文中参数为起始值，最终设置需根据具体样品与冷冻仪确定。批次相关问题请联系 sales@nanodim.cn。
© 2026 纳境鼎新。ANTcryo 技术文档 TN-001，Rev. 1.1（中文版）。

冷冻样品制备操作流程：Thermo Fisher Vitrobot Mark IV

ANTcryo 技术文档 TN-002 · Rev. 1.1 · 2026-01-01

1. 仪器与耗材

• ANTcryo 载网（膜面为无反光的哑光面）ANTcryo
• 辉光放电／等离子清洗仪（如 Gatan Solarus、PELCO easiGlow、Quorum GloQube Plus、Harrick Plasma）
• Thermo Fisher Vitrobot Mark IV 投入式冷冻仪
• 液氮（LN₂）；乙烷，或 63/37 乙烷/丙烷混合气
• Vitrobot 预打孔滤纸（Whatman No. 1 或同级别）
• Vitrobot 镊子与镊夹
• 载网存储盒；低温手套与防护面罩

2. 载网储存与取用

• 载网存放于原装网格盒中，置于避光、阴凉、低湿环境；为保证表面质量，建议在生产后 2 年内使用。ANTcryo
• 潮湿环境下，载网应密封保存在干燥容器内，使用前约 30 min 取出，平衡至室温。ANTcryo
• 使用前在光学显微镜下检查：只要支持膜无明显破损、孔型结构完整，即使载网曾被气流短暂吹飞，仍可正常使用。ANTcryo
• 特别说明：ANTcryo For Cell 系列载网（MS01/MS03）出厂时已完成亲水化处理，可直接使用；长期存放后，建议先做一次短时间等离子处理。ANTcryo

3. 辉光放电（亲水化）

辉光放电使支持膜表面转为亲水，这是获得均匀冰层、让颗粒留在孔内的前提。辉光放电处理后的载网应在 30 分钟内使用（亲水性随时间衰减）；部分流程建议在 15 min 内使用。[Wang & Zimanyi 2024；Quantifoil HexAuFoil 官方]

3.1 推荐参数

将载网膜面朝上放置在辉光放电腔室内的载玻片（或载网架）上。

3.2 ANTcryo 专属说明

• 非晶镍钛合金耐辉光放电性能好，可按需增加时间与强度。作为参照，金膜载网常用的处理时间约为 120 s [Wang & Zimanyi 2024]。ANTcryo
• 新批次首次使用时，先试 2–3 张载网摸索最佳参数，再正式上样。ANTcryo
• 单颗粒分析（SPA）的常见做法（PELCO easiGlow）：空气辉光放电 20–30 mA，碳膜 20 s，金膜 120 s，超薄碳膜 5 s。[Wang & Zimanyi 2024]

4. Vitrobot Mark IV 冷冻仪设置

冷冻仪的操作遵循已公开的 Vitrobot 操作程序。[Vitrobot Mark IV User Guide；NIH Methods Mol Biol 2024；STAR Protocols 2022]

4.1 环境腔室

4.2 每日首次使用前

• 在 blot 垫上装好新滤纸，于腔室内平衡 至少 5–10 min 后再开始 blot。滤纸每 8–10 次 blot 更换一次，或在肉眼可见受潮／污染时立即更换。[STAR Protocols 2022；NIH Methods Mol Biol 2024]
• 加湿器注入蒸馏水（约 60 ml）；冷冻腔加注液氮；待腔室冷却后将乙烷冷凝至冷冻剂杯中。
• 将镊子／乙烷杯组件升至工作位，在镊子上装载空白载网，检查 blot 垫与载网对齐是否平整。跑一次不加样的空 blot 循环。

4.3 Vitrobot Mark IV 的 blot 参数（与 Leica GP2 的差异）

Vitrobot 除 blot 时间与 blot 次数外，还有 "blot force"调节旋钮（无量纲，0–30）。blot 过程中两片 blot 垫从两侧同时接触载网。

• 从 ANTcryo 标准值起步：blot time 3 s、blot force 2、blot 1 次。该参数经多次实验验证，破损比例可控，且能稳定获得薄而均匀的冰层。ANTcryo
• 若冰层过厚，以 0.5 s 为步长延长 blot 时间，或将 blot force 略增至 3–4。若冰层过薄／孔内已干，缩短 blot 时间或降低 force。[NIH Methods Mol Biol 2024]
• 由于 Vitrobot 从两侧同时 blot，支持膜承受的机械负荷高于 Leica GP2。建议把 blot force 保持在较低值（2–3）作为第一优化方向，而不是直接跳到 force 10。ANTcryo

5. 上样

• 每张载网使用 3–4 µL 样品（典型值）。Vitrobot 的 blot 垫按此体积范围设计。[STAR Protocols 2022；NIH Methods Mol Biol 2024]
• 将液滴加在膜面一侧；移液器吸头不要触碰支持膜。
• 浓度起始值ANTcryo：
  • Apoferritin：1–1.5 mg/ml，作为标准参照（必要时筛选 2–3 个浓度）
  • 对于稀缺或难处理的样品（如膜蛋白）：镍钛表面的低吸附特性可让更多珍贵样品留在孔内；先小批量试制再放大。ANTcryo
• 可选：在湿度腔室中将液滴在载网上孵育 20–30 s 后再 blot（吸附/孵育有助于提高部分样品的颗粒密度）。[Nat Commun 2025；NIH Methods Mol Biol 2024]

6. 预期冰层表现（ANTcryo）

• 镍钛膜表面平整、亲水性均一，有利于形成 20–80 nm 的均匀冰层，减少冰层厚薄梯度。ANTcryo
• 在 ANTcryo 标准 Vitrobot 参数下（blot 3 s / force 2 / 1 次），获得约 20 nm 冰层的成功率明显高于常规碳膜。ANTcryo

7. 投入冷冻与转移

1. 将辉光放电后的载网装到 Vitrobot 镊子上（膜面朝向将要加样的一侧），夹紧镊子，将组件装到 plunge 杆上。
2. 升起镊子／乙烷杯进入湿度腔室，等待温湿度稳定。
3. 通过侧口将 3–4 µL 样品加在膜面一侧。
4. 启动自动 blot-and-plunge 序列。载网完成 blot 后投入液态乙烷。
5. 投入后，在液氮浸没状态下将载网从乙烷杯转移至转移容器中载网盒的空槽内。
6. 载网盒存放于液氮中，直至筛选或数据采集。

8. blot 后的 ANTcryo 专属观察项

8.1 滤纸上的灰黑色斑块

在 Vitrobot 上 blot 完 ANTcryo 载网后，滤纸上可能出现灰色或黑色斑块（图 1），这是正常现象。

支持膜依靠范德华力附着在金属载网上。个别载网上出现轻微的脱膜属正常范围，不代表该批次存在质量问题。ANTcryo

质量判定线 ANTcryo

若同一盒载网中有超过约 10 % 的载网出现明显脱膜（建议拍下滤纸照片留存），请保留受影响的载网与照片，联系 sales@nanodim.cn 办理一对一换新。

8.2 电镜下可见的膜破损

由于 Vitrobot 从两侧同时 blot 载网，blot 垫对支持膜施加的机械力相对较大。ANTcryo 标准支持膜厚度为 22±3 nm。因此，Vitrobot blot 后出现局部撕裂或破损的膜区属于正常现象，本身不构成产品质量投诉的依据。ANTcryo

9. 故障排查

10. 参考来源

本文档作为技术支持资料提供。文中参数为起始值，最终设置需根据具体样品与冷冻仪确定。批次相关问题请联系 sales@nanodim.cn。
© 2026 纳境鼎新。ANTcryo 技术文档 TN-002，Rev. 1.1（中文版）。